食品中微生物鑒定技術(shù)的發(fā)展歷程

2015年6月17日，“第四屆中國(guó)食品與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)技術(shù)國(guó)際論壇暨展覽會(huì)”在北京國(guó)家會(huì)議中心開(kāi)幕。此次會(huì)議特別設(shè)置了“食品與農(nóng)產(chǎn)品安全微生物檢測(cè)”、“食品與農(nóng)產(chǎn)品中重金屬元素和其他有害物質(zhì)檢測(cè)”、“飲用水安全檢測(cè)”等九個(gè)專題。大會(huì)第二天，來(lái)自北京出入境檢驗(yàn)檢疫局的曾靜博士在“食品與農(nóng)產(chǎn)品安全微生物檢測(cè)”專題中做了題為“微生物鑒定技術(shù)的發(fā)展歷程”的報(bào)告。

專題現(xiàn)場(chǎng)

北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 曾靜博士

　　隨著人們生活水平的不斷提高，食品安全問(wèn)題越來(lái)越受到人們的重視，微生物對(duì)食品的污染問(wèn)題也相應(yīng)地備受關(guān)注。微生物包括細(xì)菌、真菌等，有些微生物還是致病菌，對(duì)人體的危害很大，因此食品中微生物的檢測(cè)非常重要。

　　在報(bào)告中曾靜介紹，微生物鑒定技術(shù)在檢驗(yàn)檢疫;食品、化妝品等產(chǎn)品致病菌的檢測(cè);動(dòng)物源性致病菌的檢測(cè);植物病原細(xì)菌、真菌的檢測(cè)等工作中起到非常關(guān)鍵的作用。檢驗(yàn)檢疫工作中的微生物鑒定工作主要有判斷該菌是不是目標(biāo)的致病菌和新發(fā)現(xiàn)的菌的種類兩項(xiàng)內(nèi)容。相比而言，后者需要做更完善的實(shí)驗(yàn)，參考多種方法相互印證以后才能確定該菌的種類。

　　曾靜說(shuō)，目前微生物鑒定技術(shù)的發(fā)展有兩個(gè)方向，速度快和分型能力強(qiáng)。速度快的微生物鑒定技術(shù)主要以飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定技術(shù)為典型代表，可以在數(shù)十秒內(nèi)實(shí)現(xiàn)微生物的鑒定;分型能力強(qiáng)的鑒定技術(shù)主要包括各種基于DNA的鑒定技術(shù)。

　　在報(bào)告中，曾靜介紹，微生物鑒定技術(shù)主要有形態(tài)學(xué)觀察、全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)和依據(jù)細(xì)胞物質(zhì)進(jìn)行微生物鑒定技術(shù)等方法。她在報(bào)告中對(duì)三種方法進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。

　　據(jù)她介紹，微生物的形態(tài)學(xué)觀察主要是依據(jù)微生物的形態(tài)和生理生化反應(yīng)等特征來(lái)進(jìn)行微生物的分類和鑒定。用微生物的形態(tài)特征來(lái)鑒定微生物是由于微生物的形態(tài)比較單一，容易分辨;用微生物的生理生化反應(yīng)特征來(lái)鑒定微生物主要是依據(jù)微生物細(xì)胞壁的組成、微生物發(fā)酵產(chǎn)物和微生物對(duì)碳源、氮源等養(yǎng)分的利用。

　　曾靜同時(shí)提到這種方法相對(duì)比較繁瑣、耗時(shí)，因此近年來(lái)被全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)逐步替代。

　　她介紹道，全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)實(shí)際上是將多個(gè)生化反應(yīng)有效整合、濃縮于商業(yè)化的板卡上，方便實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的鑒定。全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.生化反應(yīng)數(shù)量多，商業(yè)化的卡板最多可集合45-46種生化反應(yīng);2.實(shí)驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)化，節(jié)省大量人工;3.鑒定速度快，一般3-4小時(shí)即可出鑒定結(jié)果。基于以上優(yōu)點(diǎn)，目前，全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)已經(jīng)作為實(shí)驗(yàn)室中微生物的日常鑒定手段。除此之外，全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)還具有細(xì)菌的MIC值測(cè)定和耐藥表型的檢測(cè)等作用。

　　曾靜在介紹依據(jù)細(xì)胞物質(zhì)進(jìn)行微生物鑒定技術(shù)時(shí)說(shuō)，該技術(shù)主要包括蛋白質(zhì)的檢測(cè)和DNA的檢測(cè)，是目前微生物鑒定技術(shù)的兩個(gè)發(fā)展方向。依據(jù)蛋白質(zhì)檢測(cè)的鑒定技術(shù)，具有鑒定速度快的特點(diǎn)，主要檢測(cè)儀器有飛行時(shí)間質(zhì)譜。基于DNA檢測(cè)的鑒定技術(shù)，對(duì)微生物的分型能力很強(qiáng)，該檢測(cè)技術(shù)主要有16S rDNA測(cè)序技術(shù)、PFGE和全基因組測(cè)序技術(shù)等。

　　在蛋白質(zhì)檢測(cè)方面，曾靜介紹說(shuō)，利用飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行微生物鑒定的原理是通過(guò)質(zhì)譜獲得微生物特征蛋白質(zhì)分子的“指紋圖譜”，然后與大容量的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，最終實(shí)現(xiàn)菌落或者菌株水平上的鑒定。質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在鑒定速度快，僅需十余秒即可完成。

　　在DNA檢測(cè)技術(shù)方面，曾靜分別就16S rDNA測(cè)序技術(shù)、PFGE和全基因組測(cè)序技術(shù)做了詳細(xì)的闡述。

　　她說(shuō)道，16S rDNA基因是細(xì)菌核糖體DNA的一部分，被稱為細(xì)菌的“活化石”，該基因進(jìn)化速度十分緩慢，具有生物鐘的特點(diǎn)，已經(jīng)作為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育的目的基因，16S rDNA序列測(cè)定是科研領(lǐng)域細(xì)菌分類和鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。目前，常見(jiàn)的商業(yè)化測(cè)序系統(tǒng)有針對(duì)細(xì)菌16S rDNA中的500bp保守序列進(jìn)行測(cè)序、針對(duì)真菌的28S rDNA的D2基因區(qū)域進(jìn)行測(cè)序等。該方法獲得的數(shù)據(jù)有利于致病菌的溯源分析，但是操作過(guò)程具有一定的復(fù)雜度，耗時(shí)較長(zhǎng)，另外，基因測(cè)序儀和測(cè)序耗材試劑的價(jià)格較貴，因此不利于在應(yīng)用層面進(jìn)行推廣。

　　報(bào)告中，曾靜對(duì)PFGE闡述道，PFGE(脈沖場(chǎng)凝膠電泳)是一種分離大分子DNA的方法。此種方法的原理是將細(xì)菌包埋于瓊脂塊中，用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在原位對(duì)整個(gè)細(xì)胞染色體進(jìn)行酶切，酶切片段在特定的電泳系統(tǒng)中通過(guò)電場(chǎng)方向的不斷交替變換和適合的脈沖時(shí)間等條件作用而得到良好分離的方法。PFGE的分型能力極強(qiáng)，可區(qū)分菌株水平的差異，目前被全世界各個(gè)國(guó)家普遍使用。通過(guò)PFGE分型可以對(duì)細(xì)菌性傳染病、食源性致病菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)可以進(jìn)行分子流行病學(xué)的調(diào)查，但是操作較為繁瑣，需要較高的實(shí)驗(yàn)技能方可掌握。

　　在全基因組測(cè)序技術(shù)方面，曾靜介紹說(shuō)，該技術(shù)可以對(duì)菌株進(jìn)行最為有效的分型，即使是16S差異不大的菌株，也可以通過(guò)分布在整個(gè)基因組上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)進(jìn)行區(qū)分，是目前分型能力最為強(qiáng)大的技術(shù)之一。全基因組測(cè)序用于微生物鑒定工作的主要障礙在于使用成本高和專業(yè)的數(shù)據(jù)分析。

　　最后，曾靜提到，對(duì)于檢驗(yàn)檢疫工作來(lái)說(shuō)，需要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的微生物鑒定方法。同時(shí)，為了更快速、更準(zhǔn)確的確認(rèn)病原微生物，可能需要幾種鑒定方法聯(lián)合使用，例如可以先利用質(zhì)譜鑒定速度快的優(yōu)勢(shì)迅速判斷致病菌，然后再利用分子生物學(xué)的手段進(jìn)行分型和流行病學(xué)的調(diào)查。