污染是細胞培養(yǎng)的大敵。預防和避免污染是細胞培養(yǎng)成功的關鍵之一。一開始就要十分重視，防止污染，否則會前功盡棄，不僅浪費時間，而且浪費人力、物力，甚至造成無法彌補的損失。

　　(一)污染的類型

　　細胞培養(yǎng)過程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質，包括生物和化學物質。

　　1、細菌污染

　　細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。

　　培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。

　　2、真菌污染

　　真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

　　培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁;倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。

　　真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。

　　

絲狀菌污染

　　3、支原體污染

　　支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結構。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。

　　培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。

    

陽性                    陰性

　　4、病毒污染

　　組織細胞培養(yǎng)過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。

　　盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。

　　5、非同種細胞污染

　　由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。

　　非細胞培養(yǎng)物所造成的化學成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質所致。

　　(二)污染的鑒別

　　1、細菌、真菌污染的檢測

　　(1)肉眼觀察

　　細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時內可明顯觀察到，例如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

　　(2)接種觀察

　　采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。

　　(3)鏡下觀察

　　在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。

　　若細胞之間有絲狀、管狀、樹枝狀或卵形的物質常為真菌污染。

　　2、支原體污染的檢測

　　(1)相差顯微鏡觀察

　　直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時可見類似于布朗運動的表現(xiàn)。應注意與細胞破碎溢出的內容物如線粒體等相區(qū)別。

　　(2)熒光染色法觀察

　　用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結合，可使支原體內的DNA著色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點，散在于細胞周圍或附于細胞表面。

　　(3)電鏡檢測

　　若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細胞培養(yǎng)48～72小時，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進行固定、包埋、切片后才能進行觀察。

　　

支原體掃描電鏡圖片

　　(4)培養(yǎng)檢測

　　將細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。

　　3 、病毒的檢測

　　1) 應用電鏡技術快速診斷動物病毒病

　　

冠狀病毒電鏡圖

　　2) 逆轉錄_聚合酶鏈反應RT_PCR檢測病毒

　　(三)污染的清除

　　培養(yǎng)細胞一經(jīng)污染，多數(shù)較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之;在尋找原因后徹底消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培養(yǎng)。

　　若污染細胞價值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。

　　一、細菌和真菌的清除

　　1、使用抗生素

　　抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。

　　二、支原體的清除

　　1、用MRA處理

　　用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細胞，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細胞純潔健康，效果好.

　　2、用清洗純化法清除支原體污染的方法

　　細胞營養(yǎng)馴化→優(yōu)質細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌

　　其原理是利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限。

　　如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。

　　3、藥物輔助加溫處理

　　先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。

　　4、使用支原體特異性血清

　　用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個月后仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟。

　　(四)、污染的預防

　　預防是防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。

　　一般預防可從以下幾方面著手：

　　1、添加抗生素

　　2、從物品、用品消毒滅菌著手

　　細胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無菌試驗陰性后才能使用。

　　操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。

　　3、從操作者做起

　　(1)進無菌室前要用肥皂洗手，按規(guī)定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。

　　(2)操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內打開瓶口，并將瓶口轉動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。

　　(3)操作時要常更換吸管，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

　　4、防止細胞交叉污染

　　在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分。

　　在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。

　　細胞一旦購置或從別處引入，均應及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復蘇培養(yǎng)。

　　5、無菌室的徹底消毒

　　1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室;

　　2)甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。