脂肪酸氣相色譜分析的故事

編者注：傅若農(nóng)教授生于1930年，1953年畢業(yè)于北京大學(xué)化學(xué)系，而后一直在北京理工大學(xué)(原北京工業(yè)學(xué)院)從事教學(xué)與科研工作。1958年，傅若農(nóng)教授開(kāi)始帶領(lǐng)學(xué)生初步進(jìn)入吸附柱色譜和氣相色譜的探索;1966到1976年文化大革命的后期，傅若農(nóng)教授在干校勞動(dòng)的間隙，系統(tǒng)地閱讀并翻譯了兩本氣相色譜啟蒙書(shū)，從此進(jìn)入其后半生一直從事的事業(yè)——色譜研究。傅若農(nóng)教授是我國(guó)老一輩色譜研究專家，見(jiàn)證了我國(guó)氣相色譜研究的發(fā)展，為我國(guó)培養(yǎng)了眾多色譜研究人才。

 

第一講：傅若農(nóng)講述氣相色譜技術(shù)發(fā)展歷史及趨勢(shì)

第二講：傅若農(nóng)：從三家公司GC產(chǎn)品更迭看氣相技術(shù)發(fā)展

第三講：傅若農(nóng)：從國(guó)產(chǎn)氣相產(chǎn)品看國(guó)內(nèi)氣相發(fā)展脈絡(luò)及現(xiàn)狀

第四講：傅若農(nóng)：氣相色譜固定液的前世今生

第五講：傅若農(nóng)：氣-固色譜的魅力

第六講：傅若農(nóng)：PLOT氣相色譜柱的誘惑力

第七講：傅若農(nóng)：酒駕判官——頂空氣相色譜的前世今生

第八講：傅若農(nóng)：一掃而光——吹掃捕集-氣相色譜的發(fā)展

第九講：傅若農(nóng)：凌空一瞥洞察一切——神通廣大的固相微萃取（SPME）

第十講：傅若農(nóng)：懸“珠”濟(jì)世——單液滴微萃取(SDME)的妙用

第十一講：傅若農(nóng)：扭轉(zhuǎn)乾坤——神奇的反應(yīng)頂空氣相色譜分析

第十二講：擒魔序曲——脂質(zhì)組學(xué)研究中的樣品處理

第十三講：離子液體柱——脂質(zhì)組學(xué)中分離脂肪酸的氣相色譜柱

     上一講我們主要介紹了在脂質(zhì)組學(xué)中對(duì)脂肪酸的分析所用的離子液體毛細(xì)管色譜柱，但是用氣相色譜分析脂肪酸源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，有許多故事，了解一些過(guò)去的故事對(duì)現(xiàn)在的發(fā)展理解有好處，溫故才可以知新。

　　先講一下脂質(zhì)組學(xué)中常常要研究的血漿分析，其中一個(gè)重要的項(xiàng)目是分析其中的脂肪酸，下面一個(gè)例子，概要介紹了血漿中脂肪酸的主要成分：

　　“雖然游離脂肪酸只占血漿中脂肪酸的一小部分，但它代表一類高度代謝活性的脂質(zhì)，脂肪組織是血漿游離脂肪酸的主要來(lái)源，其分布與食物的脂肪酸組成密切相關(guān)。在正常情況下從脂肪組織中釋放脂肪酸與組織對(duì)能量的需要緊密相連。但是當(dāng)代謝失調(diào)時(shí)，這種平衡被打亂，導(dǎo)致脂解增加，會(huì)釋放出多于組織所需要脂肪酸的量。健康人經(jīng)過(guò)一夜禁食后血漿中含有214 nmol/ml游離脂肪酸，油酸(18:1)的含量最高，其次是棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)，這三種酸占全部游離脂肪酸的78%。亞油酸(18:2)和花生四酸(20:4) 是主要的多不飽和脂肪酸(約占8%)。但是有營(yíng)養(yǎng)作用的α-亞麻酸(18:3ω-3)，二十碳五烯酸(20:5, EPA)和二十二碳六烯酸(22:6, DHA)也占有一定比例，約為全部游離脂肪酸的1%。”

1 脂肪酸氣相色譜分析的歷史故事

　　氣相色譜被認(rèn)為是分析復(fù)雜混合物中脂肪酸的可靠方法，這一方法可追述到上世紀(jì)50年代，氣相色譜的出現(xiàn)于脂肪酸的分析有密切的關(guān)系，1952年氣相色譜發(fā)明人A. T. James 和 A. J. P. Martin就用最為原始的自制氣相色譜儀分析小分子脂肪酸(Biochem J,1952,50:679),他們首次闡明氣-液分配氣相色譜的原理，設(shè)計(jì)了自動(dòng)滴定檢測(cè)脂肪酸的氣相色譜儀。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的色譜柱為玻璃柱，其內(nèi)徑為4mm，長(zhǎng)度為5英尺，固定相是把DC 550硅油涂漬在硅藻土Celite 545上。分離小分子脂肪酸的色譜如圖1所示。

 

圖1 用自動(dòng)滴定計(jì)氣相色譜儀分析小分子脂肪酸的色譜圖

　　分離從乙酸到戊酸的色譜如圖2所示：

圖 2 分離從乙酸到戊酸的色譜

　　此后分析脂肪酸的一個(gè)重大進(jìn)步是把脂肪酸進(jìn)行甲酯化，1956年James和Martin使用氣體密度檢測(cè)器，并把脂肪酸進(jìn)行甲酯化，使用阿皮松類高溫潤(rùn)滑脂作固定相，可以分離分子量大的脂肪酸。圖3 是分離C5-C13直鏈和支鏈脂肪酸甲酯的色譜圖。

圖 3 用高沸點(diǎn)潤(rùn)滑脂分離C5-C13直鏈和支鏈脂肪酸甲酯的色譜圖

色譜柱：在硅藻土載體上涂漬高沸點(diǎn)潤(rùn)滑脂；柱溫：197℃；載氣：氮?dú)?14.1mL/min;

色譜峰: (1) 空氣, (2) n-戊酸甲酯，(3) n-己酸甲酯, (4) 4-甲基己酸甲酯,

(5) 6-甲基庚酸甲酯, (6) n-辛酸甲酯, (7) 6-甲基辛酸甲酯, (8) n-壬酸甲酯,

(9) 8-甲基壬酸酯, (10) n-癸酸酯, (11) 8-甲基癸酸酯, (12) 10-甲基十一酸酯  ,

（13) n-十二酸酯, (14) 10-甲基十二酸酯

2 脂肪酸氣相色譜分析的發(fā)展

　　脂肪酸的氣相色譜分析由于它的極性和揮發(fā)性不好而帶來(lái)麻煩，所以首先要把它的極性羰基轉(zhuǎn)化成易于揮發(fā)的非極性衍生物。有多種烷基化試劑可以進(jìn)行羰基的衍生化，使用最多的是進(jìn)行甲基化，特別是使用氫火焰離子化監(jiān)測(cè)器(FID)氣相色譜時(shí)，尤為方便普及。但是使用FID也有一些不足之處。絕對(duì)的定量要依靠?jī)?nèi)標(biāo)物的信號(hào)強(qiáng)度，經(jīng)常使用的內(nèi)標(biāo)物是十七酸(而不是使用化學(xué)和物理性質(zhì)與所測(cè)定脂肪酸相近的同位素標(biāo)記脂肪酸混合物作內(nèi)標(biāo))。人類體內(nèi)不能合成奇數(shù)碳鏈的脂肪酸(包括碳17酸)，但是人們可以通過(guò)食物攝取它們，它們存在于血液的血漿中，增加內(nèi)標(biāo)物十七酸的量，從而擾亂定量分析。

　　進(jìn)一步講，F(xiàn)ID不能提供分子質(zhì)量或其他結(jié)構(gòu)特征信息，以便區(qū)分不同的脂肪酸，所以色譜和FID只是解決把所有要研究的脂肪酸分子完全分離開(kāi)，用質(zhì)譜解決脂肪酸的結(jié)構(gòu)信息。大家應(yīng)該知道使用電子轟擊電離脂肪酸分子很容易被打成碎片，通過(guò)這些碎片可以進(jìn)行脂肪酸的結(jié)構(gòu)分析，但是靈敏度受到限制。弱電離技術(shù)比如負(fù)化學(xué)電離(NCI)可以改善檢測(cè)限。使用鹵代衍生化試劑可以進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，這種試劑增加了電子親和力，可改善NCI-MS的靈敏度。Kawahara 使用五氟基芐(PFB) 作衍生化試劑來(lái)衍生化有機(jī)羧酸，這樣的含氟衍生物電子很容易被俘獲。此后這一方法擴(kuò)展到脂肪酸的衍生化為脂肪酸酯，與脂肪酸甲酯相比，它很容易被NCI-MS檢測(cè)。所以使用五氟基芐進(jìn)行衍生化有利于提高檢測(cè)靈敏度。許多研究者使用PFB做衍生化試劑進(jìn)行脂質(zhì)組學(xué)中的脂肪酸分析，例如Quehenberger等就是用這一方法分析巨噬細(xì)胞中的各種脂肪酸(Prostaglandins, Leukotrienesand Essential Fatty Acids，2008，79：123–129)。下圖4 是分析巨噬細(xì)胞中的各種脂肪酸的色譜圖。

圖 4 巨噬細(xì)胞中的各種脂肪酸的色譜圖

圖中色譜峰的脂肪酸如下：

(1)12:0; (2)14:0; (3)15:0; (4)16:1; (5)16:0; (6)17:1; (7)17:0;(8) a18:3; (9) 18:4; (10) g18:3; (11)18:2; (12)18:1; (13)18:0; (14)20:4;(15)20:5;  (16)11,14,17–20:3;(17)bishomo-20:3; (18)20:2; (19)5,8,11–20:3; (20)20:0;  (21)22:6; (22)22:4; (23)22:5; (24)22:2;(25)22:3; (26)22:1; (27)22:0; (28) 23:0; (29)24:1; (30)24:0;

3 國(guó)內(nèi)外進(jìn)行氣相色譜分析脂肪酸的一些例證

　　 為了進(jìn)一步了解進(jìn)行氣相色譜分析脂肪酸的具體情況，下面表1列出近50例分析各種樣品中脂肪酸的色譜柱和分離對(duì)象。表2列出國(guó)外文獻(xiàn)中分析人體組織中脂肪酸的例證。

表 1  國(guó)內(nèi)氣相色譜分析脂肪酸的色譜柱和分析對(duì)象

 

表 2 國(guó)外文獻(xiàn)中有關(guān)分析人體組織中脂肪酸的衍生化方法和所用色譜柱

4 脂肪酸氣相色譜分析所用色譜柱

　　從已發(fā)表的文獻(xiàn)看分析整體脂肪酸需用非極性的聚硅氧烷毛細(xì)管色譜柱，如聚二甲基硅氧烷，分離多不飽和脂肪酸需用極性強(qiáng)的色譜柱，如OV-275，OV-275(這是聚硅氧烷固定相中極性最強(qiáng)的色譜柱)和CP-Sil 88(HP-88)。 據(jù)安捷倫公司一份研究報(bào)告(5989-3760 EN)，他們對(duì)最重要的一些脂肪酸(甲酯)(見(jiàn)表3)進(jìn)行研究，研究總結(jié)認(rèn)為：聚乙二醇柱對(duì)不太復(fù)雜的樣品可以得到很好的分離;而中等極性的氰丙基聚硅氧烷柱(DB 23)對(duì)復(fù)雜的 FAMEs 樣品可以得到很好的分離，對(duì)一些順?lè)串悩?gòu)體也可以得到分離; 要使順?lè)串悩?gòu)體分離的更好，就要使用更高極性的 HP-88 氰丙基色譜柱。

表3 重要的一些脂肪酸

　　三種主要色譜柱分離脂肪酸的特點(diǎn)如下：

　　使用DB-Wax柱，DB-23 柱和HP-88 柱上分離37種脂肪酸混合物的色譜見(jiàn)圖5-圖7.

圖 5 FAMEs在30 m 0.25 mm ID, 0.25 μm DB-Wax 色譜柱上的色譜

圖 6 FAMEs混合物在 60 m 0.25 mm ID, 0.15 μm DB-23 柱上的色譜

圖 7 FAMEs 混合物 在 100 m 0.25 mm ID, 0.2 μm HP-88 柱上 的色譜

　　其中HP-88 柱的極性最強(qiáng)，是含88%氰丙基甲基聚硅氧烷，其結(jié)構(gòu)如下圖8：

圖8 HP-88 的分子結(jié)構(gòu)

　　HP-88 對(duì)一些異構(gòu)體的分離能力由于DB-23如下圖9所示

　　圖 8 HP-88和HP-23分離能力的差別

　　(此圖來(lái)自Walter Jennings博士2008年在北京大學(xué)作報(bào)告時(shí)的ppt文稿)

　　吳惠勤等使用P-88毛細(xì)管色譜柱分離了39種脂肪酸得到的質(zhì)譜基峰離子和特征離子如表4中的數(shù)據(jù)。

表4 39種脂肪酸在HP-88毛細(xì)管色譜柱上出峰次序

( 吳惠勤等，分析化學(xué)，2007，35(7)：998-1003)